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Técnica de laboratorio para la fecundación in vitro

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Caso Práctico – EL ESPERMATOZOIDE

Es siempre el resultado del análisis de espermatozoides lo que impone la técnica de AMP a utilizar en las parejas infértiles, ya sea que la infertilidad sea masculina, femenina o mixta.
Además del análisis de primera línea, que se centra en la evaluación de la calidad y cantidad del semen (numeración, movilidad, morfología), se realizarán análisis adicionales en varios casos para afinar el diagnóstico.

Abordaremos el esperma bajo diferentes aspectos:

II. 1: Origen del esperma, formación, espermatozoide funcional
II. 2: Análisis de semen
II. 3: Análisis complementario habitual:
Prueba de marea, fragmentación del ADN
II. 4: Prueba de Supervivencia Migratoria: MST
II. 5: Preparación de semen para AMPs
II. 6: Inseminación artificial en la pareja (IAC).
II. 7: Criopreservación del esperma humano

Origen de los espermatozoides

Las células madre (espermatogonía) aparecen muy temprano en el desarrollo embrionario y permanecen inactivas hasta la pubertad.
En la pubertad, la formación de espermatozoides comenzará: es la espermatogénesis que dura unos 74 días para dar un espermatozoide funcional. Es durante este período que la espermatogonía pasará del estado de espermatocito diploide primario (46 cromosomas) al estado de espermatocito secundario y luego del esperma haploide (23 cromosomas) después de haberse sometido a una meiosis de 2 divisiones sucesivas: división reductora seguida de división ecuación.

La espermiogénesis

A partir de la espermatida, el espermatozoide tardará 24 días en volverse funcional y alcanzar el lumen de los tubos seminales.
este espermatozoide no tiene todavía ningún poder fértil y sufrirá las últimas etapas de su desarrollo a lo largo de su recorrido en el epidídimo. Esta maduración implica la finalización de la formación del acrosoma y la adquisición de movilidad.

II.1.1 Productos tóxicos para la espermatogénesis

Medicamentos:
La mayoría de los medicamentos utilizados en quimioterapia.
Algunos medicamentos para el tratamiento de la hipertensión arterial (Aldomet, catapressan…..), hiperlipidemia (lipur, lipantil…), glaucoma, enfermedad de Crohn, (salazopirina…..) infecciones (bactrim, eusaprim, furadantoin), ciertos medicamentos contra la úlcera y antidepresivos, hormonas (estrógeno o progestina (farlutal) hormonas de los medicamentos “anti-hormonales”.

Sustancias adictivas:
Alcohol, Tabaco, Drogas…

Tóxicos industriales o ambientales,:
Ciertos metales pesados (manganeso, plomo, mercurio…), ciertos derivados orgánicos que contienen halógenos (cloro, bromo)
Plaguicidas, herbicidas…
Ciertos productos fabricados o utilizados por la industria (químicos, disolventes, adhesivos, masillas, etc.).
Sulfuros de carbono, éteres de glicol, carbamatos…

Factores físicos:
Radiación
Calor en todos sus aspectos: repetidos baños calientes, sauna, posición de sentado permanente (ordenadores, conducción profesional…).

II.1.2 Función de los espermatozoides

1: Acrosoma
2: Núcleo (cromatina condensada)
3: distal Centriole
4: Centriole proximal
5: Mitocondria
6: Axoneme
7: Fibras exteriores densas

Análisis del semen humano

II.2.1 Colección de esperma

Para realizar un análisis de semen, o una colección para una técnica de AMP, el período de abstinencia puede ser razonablemente de 2 a 4 días, pero no más de una semana.
La recogida se realizará en el laboratorio o clínica, según sea el caso, tras una sesión de aseo íntimo.
La licuefacción de semen se realiza normalmente en 30 minutos a 37°C. o una hora a temperatura ambiente. Puede haber anomalías en la licuefacción que deben observarse y que, en algunos casos, pueden requerir el uso de técnicas de licuefacción física para realizar un análisis adecuado.

II.2.2  Espermocultivo
Se llevará a cabo sistemáticamente en caso de previsión técnica AMP.
El cultivo será el primer paso si se va a realizar un cultivo de esperma.
Debe realizarse rápidamente si se busca N. Gonorrhoeae (gonococo).

Los gérmenes que generalmente se buscan

Micoplasmas, clamidia, gonococos,… M. Tuberculosis.

En el caso de los gérmenes potencialmente patógenos (Enterobacter, E. Coli, Proteus, Klebsielles…), se considera que una infección es manifiesta en concentraciones de gérmenes superiores a 5.000 unidades formadoras de colonias por ml: ufc/ml. Luego se realiza sistemáticamente una identificación y un antibiótico.

Los gérmenes de la flora oral, dérmica o uretral pueden estar presentes de forma natural en el semen, pero sólo se tendrán en cuenta los gérmenes de cultivo puro o muy mayoritario, siempre que su número supere los 10.000 UFC/ml.
Especialmente para los siguientes gérmenes:
Cocci: Streptococci alfa hemolítico, Staphylococcus coagulase (-)
Otros: Neisseria comensal, corinebacterias o incluso gardnerella vaginalis.

Finalmente, también podemos encontrar gérmenes nosocomiales como el bacilo de Pyocyanic (Pseudomonas aeruginosa)

Una combinación de varios gérmenes sugeriría contaminación durante el muestreo.

II.2.3 Análisis organoléptico y macroscópico

Consiste en observar el aspecto general del semen, después de la homogeneización con una pipeta pasteurizada, por ejemplo:
Estado de licuefacción, evaluación de viscosidad
Aspecto, color, a menudo relacionado con infección, reacción inflamatoria o hemospermia (sangre en el semen).

Medición del volumen

Si no se utiliza un recipiente graduado para la recogida de semen, el volumen se medirá mediante transferencia a un tubo graduado utilizando una pipeta de vidrio (pasteur) o de plástico desechable.
Los valores usuales están entre 2 y 6 ml.
Deberán investigarse todos los valores sospechosos: problema de recogida o anomalía patológica, fenómeno infeccioso, eyaculación retrógrada?

El estudio del pH se llevará a cabo sobre una tira de papel indicador de pH (6-10 unidades de pH) controlada en el plazo de una hora después de la toma de muestras, a temperatura ambiente, normalmente entre 7,2 y 8 unidades de pH.
Cualquier valor inferior a 7 debe recordar la disgénesis de los conductos deferentes de las vesículas seminales o de los epidídimos. Mientras que los valores por encima de 8 indican un fenómeno infeccioso.

II.2.4 Análisis microscópico estándar

Permite analizar los parámetros importantes del semen con un aumento microscópico del orden de 200 a 500, si es posible en contraste de fase para una visualización más cómoda, mientras que la morfología de los espermatozoides se evaluará por separado con un aumento mayor (X 1000) después de la fijación sobre la lámina y la tinción específica.

II.2.5 Conteo espermático de espermatozoides

El conteo se puede hacer con un Neubauer. En células de esperma muertas:
Diluyendo el semen entre 1/10 y 1/50 dependiendo de la concentración inicial y teñiéndolo con azul tripán.
Ya sea diluyendo el semen y haciendo una lectura directa en contraste de fase.

El conteo también se puede hacer con una celda Makler, en semen calentado a 50-60°C, sin diluir en la mayoría de los casos.

Un semen normal cuenta entre 20 y 200 millones de espermatozoides por ml.
Por debajo de 40 millones / eyacular, hablaremos de oligospermia, aunque es posible obtener embarazos de forma natural con concentraciones del orden de 5 a 10 millones por ml.
Por encima de 200 millones/ml. hablaremos de polisermia.
Es importante hacer una comparación entre el conteo de espermatozoides y el volumen de semen antes de concluir (ver arriba: volumen de espermatozoides).

La criptocrytozoospermia es una forma intermedia entre la azoospermia y la oligospermia, donde de vez en cuando se encuentran unos pocos espermatozoides después de la centrifugación (menos de 100.000 por ml).

II.2.6  La azoospermia

Es la ausencia total de espermatozoides en por lo menos 2 a 3 muestras tomadas a intervalos de 2-3 meses. El diagnóstico se realizará después de tener en cuenta las observaciones mencionadas en el capítulo relativo a la medición del volumen de esperma.
Clásicamente, hay 3 tipos de azoospermia: azoospermia excretora, azoospermia secretoria y azoospermia debido al hipogonadismo central.

La azoospermia excretora se define como la producción de espermatozoides sin emisión en el eyaculado – azoospermia obstructiva.
Típicamente en este caso, los niveles de testosterona son normales, pero las constantes bioquímicas del semen se alteran dependiendo de la localización de la obstrucción:
Dosis de fructosa para vesículas seminales
Determinación de L-carnitina o alfa-glucosidasa para el epidídimo
Dosis de fructosa para vesículas seminales
Determinación de fosfatasas ácidas (zinc o citrato) para la glándula prostática

En el caso de la anesia vesiculodeferencial (ausencia congénita de vesícula seminal y conductos deferenciales vasculares), hay una alteración característica de la bioquímica espermática:
Disminución del líquido espermático a pH ácido, fuerte disminución de la fructosa, carnitina y alfa-glucosidasa.
Aumento artificialmente incrementado de la fosfatasa ácida, ya que el líquido seminal se compone principalmente de secreciones prostáticas.
En este caso específico, la detección de mutaciones CFTR (mucoviscidosis) se asociará en caso de que se intente una técnica de AMP.

La azoospermia secretora se define como la ausencia de producción de espermatozoides.
Habitualmente hay una FSH muy aumentada (pero a veces normal) y un nivel de inhibina colapsado.
Aparte de la azoospermia debido a la radioterapia extensiva (sup. A 2 Gy) o quimioterapia antimitótica prolongada, anormalidades de cariotipo como microdeleciones en el brazo largo del cromosoma Y (10-20% de los casos) o síndrome de Klinefelter, cuya forma clásica (47XXY) representa el 90% de los casos con 10% de mosaicos o sobrecargas cromosómicas.
El hipogonadismo central, que puede ser primario o secundario y por lo general se trata con terapia de reemplazo hormonal, después de eliminar la posibilidad de un tumor hipofisario pituitario pituitario.

II.2.7 Número de otros elementos celulares

Células redondas

Las celdas redondas comprenden un conjunto de celdas de diferente origen:
Células germinales, en diferentes estados de desarrollo:

1 – espermatogonía, 2 – orden de espermatozoides I,
Su presencia a una tasa alta (superior al 10% del conteo de espermatozoides) generalmente refleja alteraciones en la espermiogénesis.
3,4,5 – espermatozoides con o sin el mismo citoplasma,
6 – Orden de los espermatocitos II

Leucocitos (leucocitos de reacción peroxidativa positiva) cuyo nivel debe ser inferior a un millón por ml, en ausencia de procesos infecciosos.
Macrófagos o linfocitos (reacción peroxidativa negativa – tinción de Heintz).

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